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祝贺郑州大学附属郑州中心医院皮肤科老师实验成功并发表文献
人阅读 发布时间：2017-08-07 10:17
祝贺郑州大学附属郑州中心医院皮肤科老师实验成功并发表文献
人表皮干细胞复合裸鼠脱细胞真皮支架制备的人工皮肤
赵跃华1，张永红2，林 凯3(1漯河医学高等专科学校第二附属医院皮肤科，河南省漯河市 462300；2郑州大学附属郑州中心医院皮肤科，河南省郑州市 450007；3河南省实验动物中心，河南省郑州市 450000)
http://pan.baidu.com/s/1i53gnEP
引用本文：赵跃华，张永红，林凯. 人表皮干细胞复合裸鼠脱细胞真皮支架制备的人工皮肤[J].中国组织工程研究，2016，20(25): 3771-3777.
DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.25.019 ORCID: 0000-0002-3506-1706(赵跃华)
文章快速阅读：
文题释义：
脱细胞真皮：是通过一定的化学和生化等手段，获得仅具有真皮基质(即细胞间质)材料的过程。在处理过程中，选择的原材料可以是异种皮或者同种异体皮，经过一定的处理之后，异种皮或者同种异体皮的细胞膜结构以及细胞内成分均被取出，仅剩余所需的细胞间质。
表皮干细胞：在胎儿时期主要集中于初级表皮嵴，至成人时呈片状分布在表皮基底层。表皮干细胞在组织结构中位置相对稳定，一般是位于毛囊隆突部皮脂腺开口处与竖毛肌毛囊附着处之间的毛囊外根鞘。在没有毛发的部位如手掌、脚掌，表皮干细胞位于与真皮乳头顶部相连的基底层；在有毛发的皮肤，表皮干细胞则位于表皮基部的基底层。其中有1%-10%的基底细胞为干细胞。不同发育阶段的人皮肤表皮干细胞的含量不同。胎儿期表皮基底层增殖细胞均为表皮干细胞和短暂扩增细胞，而少儿表皮基底层中部分细胞为表皮干细胞和暂时扩增细胞，成人表皮干细胞和暂时扩增细胞所占比例则进一步降低。
摘要
背景：多种原因会导致皮肤大面积缺损的出现，临床可采用组织工程人工皮肤进行移植修复，而构建组织人工皮肤需要种子细胞和支架材料。
目的：观察人表皮干细胞复合裸鼠脱细胞真皮构建的组织工程人工皮肤的应用效果。
方法：①取幼儿包皮分离培养人表皮干细胞，取裸鼠皮肤制备脱细胞真皮支架，将两者复合构建人工皮肤。②10只SD大鼠随机等分为组织工程皮肤组和脱细胞真皮支架组，均制备皮肤缺损模型，分别采用移植脱细胞真皮支架与人表皮干细胞复合物与单纯脱细胞真皮支架进行修复。
结果和结论：①人工皮肤均呈乳白色，质地柔软且富有弹性，柔韧性好，不易断裂，并具有良好的随形性，可加工为不同的形状。②2组大鼠修复后创面均未出现明显渗出。造模后2周，组织工程皮肤组裸鼠移植皮肤均呈现出良好的生长状态，创面逐渐愈合。脱细胞真皮支架组出现瘢痕愈合，且2只动物移植失败。③结果表明，以人表皮干细胞为种子细胞，以裸鼠脱细胞真皮材料为支架，可复合获得组织工程皮肤，并对皮肤缺损动物具有良好的修复效果。
关键词：
生物材料；材料相容性；人表皮干细胞；种子细胞；支架材料；脱细胞真皮支架；皮肤缺损；皮肤移植；动物模型
主题词：
表皮；支架；组织工程
基金资助：
河南省医学科技攻关计划项目(201402103)
Human epidermal stem cells combined with acellular dermal scaffold in nude mice for skin transplantation
Zhao Yue-hua1, Zhang Yong-hong2, Lin Kai3 (1Department of Dermatology, the Second Affiliated Hospital of Luohe Medical College, Luohe 462300, Henan Province, China; 2Department of Dermatology, Affiliated Zhengzhou Central Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450007, Henan Province, China; 3Experimental Animal Center of Henan, Zhengzhou 450000, Henan Province, China)
Abstract
BACKGROUND: Many factors can lead to a large area of skin defects, and tissue-engineered artificial skill transplantation composed by seeding cells and scaffold materials can be used for skin defect repair.
OBJECTIVE: To construct the skin implantation scaffold based on human epidermal stem cells combined with acellular dermal matrix in nude mice.
METHODS: Human epidermal stem cells from children’s foreskin were isolated and cultured, and the skin of nude mice was obtained to prepare acellular dermal matrix scaffold. Then, the human epidermal stem cells were cultured on the acellular dermal matrix scaffold to construct artificial skin. Ten Sprague-Dawley rats were equivalently randomly divided into two groups: rats treated by human epidermal stem cells combined with acellular dermal matrix scaffold as combined group, and those treated by simple acellular dermal scaffold as acellular dermal scaffold group after skin defect models were prepared.
RESULTS AND CONCLUSION: The artificial skin was milky white, soft and elastic, not easy to break, and has good flexibility, and good plasticity, and could be processed into different shapes. No obvious exudation appeared in the rat wound of two groups after repair. At 2 weeks after modeling, the transplanted skin showed good growth and skin wound healed gradually in the combined group. In contrast, scar healing and two animals with transplant failure occurred in the acellular dermal scaffold group. These results show that human epidermal stem cells combined with acellular dermal materials in nude mice can construct the tissue-engineered skin, which exerts good repair effects for skin defects in animals.
Subject headings: Epidermis; Stents; Tissue Engineering
Funding: the Medical Science and Technology Research Project in Henan Province, No. 201402103
Cite this article: Zhao YH, Zhang YH, Lin K. Human epidermal stem cells combined with acellular dermal scaffold in nude mice for skin transplantation. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(25):3771-3777.
0 引言 Introduction
临床上对的皮肤缺损修复大多采用自体或者异体皮肤移植的方式，但其中自体移植在来源方面受到较大的限制，且容易对患者造成二次创伤，而异体移植则存在排异等风险[1-2]。随着组织工程学理论和技术的不断发展，临床开始积极的通过构建组织工程皮肤的方式进行皮肤移植治疗[3]。
在皮肤构建过程中，需要种子细胞以及支架材料。表皮干细胞是一种重要的干细胞类型，具有很强的自我更新能力[4]。在一定的条件下，表皮干细胞可以分化为皮肤，是一种十分理想的组织工程种子细胞[5]。脱细胞真皮仅具有真皮基质，完整保留了细胞外基质的结构和形态、成分、基底膜等，为各种种子细胞的生长和分化提供了所需的环境，是一种理想的支架材料[6-7]。实验拟采用脱细胞真皮支架复合人表皮干细胞方式构建皮肤复合物，并移植修复皮肤缺损的动物模型，通过分析修复效果，为临床皮肤修复提供实验依据。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 实验于2015年7至8月在漯河医学高等专科学校第二附属医院实验室完成。
1.3 材料 幼儿包皮由1例接受包皮环切切除8岁的患者提供，患者监护人对实验目的及过程均知情同意，并签署知情同意书，同意将幼儿包皮用于科学研究。
健康雄性裸鼠1只，鼠龄3个月，由北京市维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SYXK(京)2013- 0032(图1A)。SPF级健康雄性SD大鼠10只，鼠龄8周，由斯贝福(北京)实验动物科技有限公司提供，许可证号SYXK(京)2014-0037(图1B)。实验相关内容和方案设计均提交漯河医学高等专科学校第二附属医院医学伦理部门申请，并经批准，实验过程中的动物处理等步骤均符合医学伦理相关要求。
1.4 方法
1.4.1 人表皮干细胞分离与培养 取适量包皮标本，利用醋酸洗必泰溶液进行浸泡，生理盐水洗。眼科剪修剪为小块。置于中性蛋白酶中进行消化4 ℃过夜，去上清，D’ Hanks液洗。分离表皮和真皮层，添加胰蛋白酶和EDTA，置于二氧化碳培养箱中进行孵育。孵育结束添加含血清培养基终止消化，利用K-SFM机械吹打表皮层，筛网过滤。离心之后去掉上清，添加K-SFM，制备细胞悬液。将细胞接种在培养皿(Ⅳ型胶原铺底)中，添加胎牛血清，置于二氧化碳培养箱中进行培养，每2 d或3 d换液1次，进行细胞计数，描绘生长曲线，并置于倒置显微镜下观察细胞生长状况，收集第3代细胞用于后续实验。取第3代细胞，利用大鼠抗人角蛋白19抗体、大鼠抗人角蛋白15抗体、兔抗β1整合素多克隆抗体行免疫组化检测进行鉴定。
1.4.2 裸鼠脱细胞真皮支架的制作 对裸鼠局部皮肤进行络合碘消毒，无菌条件下剥取皮肤。将剥下的皮肤浸入新洁尔灭中进行消毒，并利用等渗盐水进行冲洗，D-Hank’s液浸泡。PBS洗涤，并修剪为小方块，置于NaCl中恒温振荡24 h进行脱表皮处理。PBS多次洗涤，胰蛋白酶消化24 h后，PBS洗，并置于柠檬酸盐缓冲中进行妥善保存。
1.4.3 组织工程皮肤制备 对裸鼠脱细胞真皮支架进行环氧乙烷低温消毒灭菌，并利用尖针对进行处理，获得密刺孔隙，将Ⅳ型胶原铺于脱细胞真皮基底膜面侧，静置状态下过夜。过夜之后去除多余Ⅳ型胶原蛋白，紫外线照射消毒。过夜之后利用含双抗PBS进行洗涤，自然晾干后接种人表皮干细胞，接种密度为1×105/cm2。利用低钙高糖DMEM培养基进行培养，并添加适量胎牛血清和氢化可的松、表皮细胞生长因子、CaCl2，置二氧化碳培养箱中进行培养。每3 d换液1次，连续培养 10 d之后进行气液界面培养，继续培养5 d。制备完成之后妥善保存，备用。按照上述方法每日进行细胞观察，于低倍镜下进水细胞计数，描绘生长曲线，并与表皮干细胞单独培养的细胞增殖情况进行比较。
1.4.4 皮肤缺损模型的制备及修复 将10只SD大鼠随机等分为组织工程皮肤组和脱细胞真皮支架组。2组大鼠均建立大面积深层皮肤缺损模型[8]：对动物予以体积分数10%水合氯醛麻醉，待达到麻醉效果之后，于动物背部尾端制备正方形切口，大小为15 mm×15 mm，进行深至肌筋膜的全层皮肤切除，获得大面积深层皮肤缺损模型。
造模后即刻，组织工程皮肤组和脱细胞真皮支架组大鼠分别移植人表皮干细胞复合裸鼠脱细胞真皮支架组织工程皮肤和脱细胞真皮支架。将不同移植材料修剪为16 mm×16 mm，覆盖在创面上，妥善缝合之后进行加压包扎。
1.4.5 术后处理 造模后对2组动物进行常规抗感染等治疗，定时更换包扎敷料，并置于相同的环境下进行喂养。
1.4.6 大体观察 造模后观察2组动物的一般情况。造模后2周，裸眼观察皮肤移植效果。
1.4.7 病理学观察 移植后4周，采集局部皮肤组织制备切片进行苏木精-伊红染色。将皮肤组织标本置于 40 g/L中性多聚甲醛4 ℃中进行固定，12 h后取出，常规脱水透明。石蜡包埋后制备切片，脱蜡至水，梯度乙醇处理后苏木精染色，泛蓝后自来水冲洗。添加伊红染液，自来水冲洗后置于显微镜下进行观察。
1.5 主要观察指标 ①人表皮干细胞形态。②人工皮
肤构建结果。③人工皮肤移植修复效果。
1.6 统计学分析 对研究过程中的相关数据予以完整记录与收集，使用SPSS 18.0软件进行统计学分析。
2 结果 Results
2.1 人表皮干细胞的形态与鉴定 倒置相差显微镜下可见人表皮干细胞接种后均匀分布，细胞体积小，呈圆形；培养7 d后细胞出现紧密接触。经鉴定，角蛋白19、角蛋白15、β1整合素均呈阳性表达(图2)。
2.2 人表皮干细胞的生长曲线 单独培养与共培养的人表皮干细胞在培养4 d后均出现迅速增殖现象，生长情况无明显差异(图3)。
2.3 裸鼠脱细胞真皮支架与人工皮肤 裸鼠脱细胞真皮支架与人工皮肤均呈乳白色，质地柔软且富有弹性，柔韧性好，不易断裂，并具有良好的随形性，可加工为不同的形状(图4)。
2.4 实验动物数量分析 所有动物均进入最终的结果分析，未出现脱落。
2.5 大体情况 2组SD大鼠麻醉清醒之后均能够自由活动，饮食、饮水情况正常，创面未出现明显的渗出现象。
造模后2周，组织工程皮肤组大鼠移植皮肤均呈现出良好的生长状态，触之质地柔软，呈淡红色(图5A)，且创面逐渐收缩，皮肤边缘有明显的愈合痕迹，未出现移植失败动物。脱细胞真皮支架组移植区域呈现出瘢痕愈合，触之质地偏硬，有2只动物出现移植皮肤变成褐色，变硬坏死，移植失败(图5B)。
2.6 病理变化 苏木精-伊红染色结果显示，脱细胞真皮支架组表面未观察到细胞结构，基底呈现出疏松状态，存在大量炎细胞浸润现象；组织工程皮肤组可观察到表面1或2层皮肤样结构细胞，基底呈现致密状态，存在少量少许炎细胞浸润(图6)。
3 讨论 Discussion
皮肤是一种天然的屏障，可以发挥出强大的保护作用，保证人体不受到一定物理损伤或者疾病的影响[9]。另外，作为人体最大的器官，皮肤还具备辅助体温调节等作用。但受到疾病或者外伤等因素的影响，极易导致不同程度皮肤损伤的出现[10]。
对于存在大面积皮肤损伤的患者，如果不及时进行皮肤移植，极易出现体液流失和感染等情况，甚至导致患者的死亡[11-12]。临床进行皮肤移植的时候，以往大多选择患者自体皮肤移植的方式，但自体皮肤移植会对患者造成不同程度的二次损伤，且供皮程度受到较大的限制[13-15]。而采用异体移植的方式，虽然供皮程度不受限制，但所使用的皮肤缺乏真皮成分，且易导致修复外观效果不佳等问题的出现，因此大多无法获得理想的修复效果，术后在局部功能以及外观等方面效果均不令人满意[16-19]。而组织工程人工皮肤的出现，则为各种原因导致皮肤缺损修复提供了新的思路。
在构建组织工程人工皮肤的的时候，需要使用一定的种子细胞和支架材料。构建过程中，通过将一定数量的种子细胞接种在支架材料上，细胞通过生长和分泌细胞外基质等过程，可以形成具有一定结构和功能的组织等[20-21]。表皮干细胞是一种重要的干细胞类型，具有很强的自我更新能力。在一定的条件下，表皮干细胞可以发生分裂，并分化为皮肤，是一种十分理想的组织工程种子细胞[22]。在支架材料方面，理想的支架材料应该具有良好的空间结构等特点，从而为细胞的长入等提供良好的空间基础[23]。构建组织工程皮肤需要选择组织相容性好、抗原性弱的适宜真皮支架材料来种植种子细胞。脱细胞真皮是通过一定的化学和生化等手段，获得仅具有真皮基质(即细胞间质)材料的过程[24]。在处理过程中，选择的原材料可以是异种皮或者同种异体皮，经过一定的处理之后，异种皮或者同种异体皮的细胞膜结构以及细胞内成分均被取出，仅剩余所需的细胞间质[25]。脱细胞真皮材料对细胞外基质的结构和形态、成分、基底膜等予以了完整的保留，有利于种子细胞的生长和分化，是一种理想的支架材料[26-33]。实验以人表皮干细胞作为构建支架的种子细胞，并且以裸鼠脱细胞真皮作为支架材料进行复合构建。在进行脱细胞处理的时候，选择利用Ⅳ型胶原对细胞中过多的胶原蛋白进行处理，并获得实验所需的支架材料。实验采用人表皮干细胞复合裸鼠脱细胞真皮支架对病灶皮肤进行抑制，通过支架植入后与细胞组织的相互融合、作用，从而形成具备一定机体功能和结构的组织等。实验结果显示，造模后2周，组织工程皮肤组裸鼠移植皮肤均呈现出良好的生长状态，触之质地柔软，呈淡红色。且创面逐渐收缩，皮肤边缘有明显的愈合痕迹，未出现移植失败动物。而脱细胞真皮支架组则有2只动物出现移植皮肤变成褐色，变硬坏死，移植失败。经苏木精-伊红染色也发现，组织工程皮肤组可观察到表面1或2层皮肤样结构细胞，基底呈现致密状态，存在少量少许炎细胞浸润。分析出现上述结果的原因，是因为脱细胞真皮去除了引发宿主排斥反应的细胞成分，完整地保留了细胞外基质的形态结构和组成成分，抗原性弱．可诱导具有再生能力的成纤维细胞。在与一定的种子细胞复合之后，可以促进血管内皮细胞按照应有的组织学方式长入真皮层，获得更好的应用效果。结果表明所使用的组织工程皮肤具有良好的修复效果，种子细胞具有良好的分化能力，以脱细胞真皮为支架发生生长和分化，为创面的修复提供所需的真皮组织，很好的对缺损部位进行修复[34-36]。在支架材料中还保留了基底膜复，可以为上皮细胞的移行以及定植提供作序的平面，有利于局部的上皮化，并有效减轻瘢痕的形成以及挛缩等的出现[37-38]。
综上所述，以人表皮干细胞为种子细胞，以裸鼠脱细胞真皮材料为支架，复合获得组织工程皮肤，并对皮肤缺损动物进行移植治疗可以获得良好的修复效果。与自体皮肤相比，组织人工皮肤不用从患者身上取皮肤，可以减少患者的痛苦，避免二次创伤，同时具有良好的修复效果，具有一定的临床应用价值。
作者贡献：第一作者负责设计和实施，第二作者负责实施及文章的修改。
利益冲突：文章所有作者共同认可文章无相关利益冲突。
伦理问题：实验方案经漯河医学高等专科学校第二附属医院伦理委员会批准，实验方案已经患者/家属知情同意。实验方案经漯河医学高等专科学校第二附属医院动物实验伦理委员会批准。实验动物在水合氯醛麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。
文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲审核，符合本刊发稿宗旨。
作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。
文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。
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